滅活劑是(shì)指能緻死細菌或病毒，使其失去複制能力或緻病力（毒力）的(de)化學物質。凍幹保護劑是(shì)指冷凍真空幹燥的(de)生物制品中抗原活性物質以(yǐ)外的(de)添加物。滅活和(hé / huò)凍幹對生物制品的(de)抗原含量、核酸含量、免疫原性、穩定性和(hé / huò)保存期影響較大(dà)。不(bù)同滅活和(hé / huò)凍幹技術的(de)原理并不(bù)同，需根據微生物類型和(hé / huò)制備目的(de)，針對性選擇适用的(de)滅活劑和(hé / huò)凍幹劑。
生物制品意義上(shàng)的(de)滅活是(shì)指利用物理或化學方法，破壞微生物生物學活性，使其喪失繁殖能力和(hé / huò)緻病能力，但仍然保留反應原性和(hé / huò)免疫原性的(de)過程。目前多用化學方法進行微生物的(de)滅活，用來(lái)滅活的(de)化學試劑或藥物等稱爲(wéi / wèi)滅活劑( inactivator ) 。使用化學滅活劑進行滅活是(shì)制備滅活疫苗最重要(yào / yāo)的(de)手段，化學滅活劑的(de)滅活效能與使用劑量、滅活時(shí)間、滅活時(shí)的(de)溫度及溶液的(de)pH等都與滅活疫苗的(de)質量密切相關。 β-丙内酯（BPL）對病毒有較強的(de)滅活作用，其作用機制不(bù)是(shì)直接作用于(yú)殼蛋白，而(ér)是(shì)通過改變微生物核酸結構達到(dào)滅活的(de)目的(de)。大(dà)劑量BPL是(shì)一(yī / yì ／yí)種潛在(zài)的(de)緻癌物，但其極易水解。BPL滅活周期短，經濟效益高，但相較甲醛價格較高；對病毒有較強的(de)殺滅作用，低質量濃度的(de)BPL（2~4mg/L）可以(yǐ)破壞病毒核酸，但不(bù)改變病毒蛋白質。試驗結果顯示：BPL對禽流感病毒的(de)最佳滅活條件爲(wéi / wèi)1：3000滅活24h，或1：1000滅活18h；對H9N2亞型AIV滅活能力強，對血凝素影響小，易水解成無害無殘留産物；分别以(yǐ)BPL、甲醛爲(wéi / wèi)滅活劑制備H9N2亞型AIV滅活疫苗，免疫SPF雞和(hé / huò)廣西土雞，其免疫效果接近。 甲醛是(shì)最古典和(hé / huò)應用最廣的(de)滅活劑。早在(zài)1911年，Lowenstein和(hé / huò)Eisler就(jiù)開始用甲醛處理破傷風毒素。1924年，Puntoni以(yǐ)0.1%甲醛制成犬瘟熱疫苗。甲醛爲(wéi / wèi)無色氣體，易溶于(yú)水和(hé / huò)乙醇，水溶液稱爲(wéi / wèi)福爾馬林，通常濃度爲(wéi / wèi)36%-40%，有強烈的(de)刺激性。長期低溫或受凍保存，可以(yǐ)聚合而(ér)成三聚甲醛或多聚甲醛。 甲醛對微生物核酸和(hé / huò)蛋白都有破壞作用。甲醛可與核酸中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等含氨基堿基結合，使微生物核酸變性；與微生物蛋白的(de)氨基結合形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，後者與酰胺交聯，使微生物蛋白變性，從而(ér)阻止其核酸逸出(chū)。甲醛滅活微生物也(yě)存在(zài)一(yī / yì ／yí)些缺點：作用于(yú)病毒殼蛋白時(shí)，容易與酰胺交聯形成屏障而(ér)使作用于(yú)核酸的(de)效率下降，導緻滅活周期較長；滅活效果容易受到(dào)溫度、pH、微生物種類、濃度的(de)影響；具有緻癌性，會使機體産生刺激反應。甲醛對單鏈核酸最有效，因此常被用來(lái)滅活RNA病毒。适當濃度的(de)甲醛可使被滅活微生物的(de)抗原性和(hé / huò)血凝性保持不(bù)變。根據AIV滅活試驗，發現用0.1%的(de)甲醛滅活AIV16h後，病毒全部死亡，18h爲(wéi / wèi)最佳滅活時(shí)間。 烷化劑（alkylating agent）是(shì)含有烷基的(de)分子(zǐ)中去掉一(yī / yì ／yí)個(gè)氫原子(zǐ)基團的(de)化合物，它能與另一(yī / yì ／yí)種化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。這(zhè)類化合物的(de)化學性質活潑，其滅活機制主要(yào / yāo)在(zài)于(yú)烷化DNA分子(zǐ)中的(de)鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯，妨礙RNA的(de)合成，從而(ér)抑制細胞的(de)有絲分裂。也(yě)可與酶系統和(hé / huò)核蛋白起作用而(ér)幹擾核酸的(de)代謝。 烷化劑主要(yào / yāo)包括二乙烯亞胺（BEI）、乙酰基乙烯亞胺（AEI），是(shì)常用滅活劑，化學性質活潑。烷化劑可以(yǐ)與蛋白質相互作用，破壞蛋白質高級結構，使病毒完全喪失傳染性，但不(bù)損傷表面結構蛋白，從而(ér)保留其抗原性，因此是(shì)制備滅活病毒疫苗的(de)良好滅活劑。目前，用BEI滅活制備的(de)疫苗已使用于(yú)動物中，尚未在(zài)動物體内發現BEI殘留。烷化劑作爲(wéi / wèi)滅活劑，對生産成本、保存條件要(yào / yāo)求較高，對細菌滅活效果一(yī / yì ／yí)般。 在(zài)食品、藥品以(yǐ)及生物體的(de)冷凍幹燥和(hé / huò)儲藏過程中，很多因素（如化學成分、凍結速率、凍結和(hé / huò)脫水應力、玻璃化轉變溫度、幹燥固體中剩餘水分、儲藏環境的(de)溫度和(hé / huò)濕度等）都會影響其中活性組分的(de)穩定性，甚至會導緻失活。大(dà)量的(de)實驗研究表明，除了(le／liǎo)一(yī / yì ／yí)些食品、人(rén)血漿、牛奶等少數物料可以(yǐ)直接冷凍幹燥外，大(dà)多數的(de)藥品和(hé / huò)生物制品，都需要(yào / yāo)添加合适的(de)冷凍幹燥保護劑和(hé / huò)添加劑，配制成混合液後，才能進行有效的(de)冷凍幹燥和(hé / huò)儲藏。按保護劑功能和(hé / huò)性質分類可分爲(wéi / wèi)：凍幹保護。即在(zài)凍結和(hé / huò)幹燥過程中，可以(yǐ)防止活性組分發生變性的(de)物質；填充劑。能防止有效組分随水蒸汽一(yī / yì ／yí)起升華逸散，并使有效組分成形的(de)物質；抗氧化劑。用作防止生物制品在(zài)冷凍幹燥過程以(yǐ)及儲藏過程中發生氧化變質的(de)物質；酸堿調整劑。在(zài)冷凍幹燥過程和(hé / huò)儲藏過程中，能将生物制品的(de)pH調整到(dào)活性物質的(de)最穩定區域的(de)物質。 凍幹保護劑的(de)主要(yào / yāo)作用機制：将病毒凍結，使其中冰晶升華，從而(ér)達到(dào)低溫脫水，防止活性物質流失結構水的(de)目的(de)，以(yǐ)降低對生物活性的(de)影響；降低胞内外滲透壓差，維持細胞活力；保護或提供病毒恢複所需營養物質，使活性物質自我修複。在(zài)選擇凍幹保護劑時(shí)，要(yào / yāo)考慮保護核衣殼結構蛋白結構和(hé / huò)核酸穩定性。常用的(de)凍幹保護劑有糖類、氨基酸、蛋白質和(hé / huò)大(dà)分子(zǐ)明膠等。碳水化合物和(hé / huò)蛋白質是(shì)生物制品相關研究中最爲(wéi / wèi)常見的(de)兩種保護劑。對多品種生物制品分析發現，因微生物（或抗原蛋白）結構特點各不(bù)相同，适用于(yú)它的(de)凍幹保護技術也(yě)不(bù)同，所以(yǐ)沒有一(yī / yì ／yí)種通用于(yú)各種生物制品的(de)“萬能”保護劑。 糖類在(zài)微生物凍幹過程中的(de)保護作用機制有兩種假說(shuō)：一(yī / yì ／yí)是(shì)糖類的(de)羟基在(zài)幹燥和(hé / huò)脫水過程中與蛋白質的(de)極性基團形成氫鍵，進而(ér)取代蛋白質上(shàng)的(de)水分子(zǐ)，形成一(yī / yì ／yí)層水化膜，防止氫鍵暴露，從而(ér)穩定蛋白質的(de)高級結構，維持病毒的(de)抗原性；二是(shì)含糖溶液在(zài)凍幹過程中會玻璃化，而(ér)糖類所處的(de)狀态爲(wéi / wèi)玻璃态。在(zài)玻璃态下，糖類保護劑黏度較高，分子(zǐ)擴散系數較低，因而(ér)會将蛋白質分子(zǐ)包裹，形成一(yī / yì ／yí)種碳水化合物玻璃體，從而(ér)維持了(le／liǎo)蛋白質分子(zǐ)結構，起到(dào)保護作用。 研究表明：單糖中，半乳糖的(de)保護效果最佳；二糖的(de)保護效果普遍較好；三糖中的(de)棉子(zǐ)糖對細菌的(de)保護作用最好。另外，海藻糖和(hé / huò)蔗糖用作保護劑時(shí)效果最好，當使用50g/L的(de)海藻糖時(shí)，菌群存活率達到(dào)83%左右，當使用100g/L的(de)蔗糖時(shí)，存活率達到(dào)75%左右。此外，海藻糖分子(zǐ)較小，能填補蛋白質分子(zǐ)的(de)空隙，有效限制蛋白質分子(zǐ)内部結構變化，從而(ér)起到(dào)保護病毒蛋白外殼的(de)作用。 在(zài)冷凍過程中，低濃度的(de)甘氨酸可以(yǐ)抑制由于(yú)磷酸緩沖鹽結晶所緻的(de)pH變化，并防止蛋白質變性。結晶型甘氨酸的(de)主要(yào / yāo)作用是(shì)提升凍幹品的(de)塌陷溫度，防止破壞蛋白質結構。常見氨基酸保護劑主要(yào / yāo)包括精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、色氨酸、酪氨酸。研究發現，2%谷氨酸鈉、2%L-精氨酸鹽酸鹽、2%D-山梨醇、7.6% 酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明膠、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的(de)配方，可使豬僞狂犬病病毒凍幹保護率達到(dào)80.40%。 蛋白質保護劑主要(yào / yāo)包括脫脂乳、血清白蛋白、大(dà)豆蛋白、膠原蛋白，其能夠阻止病毒蛋白質表面吸附，從而(ér)對凍幹過程中多數蛋白都能起到(dào)保護作用。此外，蛋白質可以(yǐ)在(zài)微生物細胞外形成保護，在(zài)冷凍幹燥過程中，蛋白質溶液中的(de)保護劑與蛋白質分子(zǐ)之(zhī)間相互作用，增加冷凍混合物的(de)玻璃化轉變溫度，大(dà)大(dà)增加微生物蛋白質的(de)穩定性。采用質量濃度爲(wéi / wèi)10.49%脫脂乳與4.22%葡萄糖混合後凍幹副幹酪乳酸菌，當凍幹厚度爲(wéi / wèi)0.3cm時(shí)，菌體細胞存活率最高，達到(dào)94.90%。 滅活和(hé / huò)凍幹是(shì)獸醫生物制品生産中必不(bù)可少的(de)技術之(zhī)一(yī / yì ／yí)。目前，我國(guó)大(dà)部分生物制品主要(yào / yāo)使用甲醛滅活。該方法技術成熟，價格低廉，但使用甲醛作滅活劑存在(zài)破壞免疫原性、有緻癌風險、滅活時(shí)間長等問題，難以(yǐ)适應新型疫苗發展。雖然 新型滅活劑研究也(yě)已逐步開展，但大(dà)多仍局限于(yú)實驗室研究階段。凍幹工藝技術直接影響生物制品的(de)保存、運輸和(hé / huò)使用。由于(yú)不(bù)同保護劑的(de)保護機制各不(bù)相同，單一(yī / yì ／yí)保護劑不(bù)能滿足微生物抵抗惡劣環境的(de)需求，因此在(zài)凍幹過程中常采用不(bù)同類型的(de)保護劑，按照合适的(de)濃度配比進行協同保護，從而(ér)強化保護效果，保證微生物存活率最大(dà)化。
