【獸藥名稱】非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒

【主要(yào / yāo)成分與含量】

【作用與用途】用于(yú)豬全血、血清、脾髒、淋巴結、肌肉等組織樣品及糞便樣品中非洲豬瘟病毒DNA的(de)檢測。

【用法與判定】

1  用法

1.1  樣品采集、保存及運輸

1.1.1  樣品采集

1.1.1.1  活豬樣品  無菌采集EDTA抗凝血，或采血後按常規方法分離血清。

1.1.1.2  病死豬或屠宰豬樣品  無菌采集脾髒、淋巴結、肌肉等組織樣品。

1.1.1.3  病豬所處環境樣品  采集糞便樣品。

1.1.2  樣品保存  所有待檢樣品在(zài)2～8℃保存應不(bù)超過24小時(shí)；在(zài)-20℃保存應不(bù)超過6個(gè)月；長期保存時(shí)，以(yǐ)-70℃以(yǐ)下爲(wéi / wèi)宜。

1.1.3  樣品運輸  樣品一(yī / yì ／yí)定要(yào / yāo)放置在(zài)有幹冰或冰塊的(de)冷藏包中，保持全程冷鏈運輸。要(yào / yāo)求在(zài)運輸至實驗室時(shí)，幹冰仍覆蓋标本或冰塊仍未完全融化。

1.2  樣品處理

1.2.1  抗凝血和(hé / huò)血清處理  取抗凝血或血清200µl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.2  組織樣品處理  分别從待檢組織三個(gè)不(bù)同的(de)部位稱取樣品約1g，用手術剪剪碎混勻，再取0.05g于(yú)研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續研磨，待勻漿後轉至1.5ml滅菌離心管中，8000r/min離心2分鍾，取上(shàng)清液200µl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.3  糞便樣品處理  取0.3g樣品于(yú)研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續研磨，待勻漿後轉至1.5ml滅菌離心管中，8000r/min離心2分鍾，取上(shàng)清液200µl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.4  陽性對照處理  取陽性對照200µl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.5  陰性對照處理  取陰性對照200µl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.3  病毒DNA的(de)提取

1.3.1  取已處理的(de)樣品、陰性對照和(hé / huò)陽性對照，分别加入200µl消化液和(hé / huò)20µl蛋白酶K，振蕩混勻後，置56℃水浴中消化，每5分鍾渦旋振蕩一(yī / yì ／yí)次，共消化15分鍾。

1.3.2  從水浴鍋中取出(chū)樣品管，降至室溫後，加入200μl DNA結合液，颠倒混勻，将全部液體移入吸附柱中（吸附柱要(yào / yāo)套上(shàng)收集管，吸取液體時(shí)盡量不(bù)要(yào / yāo)吸到(dào)懸浮雜質，以(yǐ)免離心時(shí)堵塞吸附柱），室溫靜置3分鍾，10000r/min離心30秒。

1.3.3  棄去收集管中液體，加入500μl DNA洗滌液，10000r/min離心30秒。

1.3.4  重複步驟1.3.3。

1.3.5  棄去收集管中液體，10000r/min空柱離心1分鍾，以(yǐ)除去殘留的(de)DNA洗滌液。

1.3.6  将吸附柱放入新的(de)1.5ml離心管中，向柱中央加入DNA洗脫液50μl，室溫放置2分鍾，10000r/min離心30秒，離心管中液體即爲(wéi / wèi)模闆DNA。

1.4  實時(shí)熒光PCR操作

1.4.1  反應體系配制  設被檢樣品、陰性對照和(hé / huò)陽性對照的(de)份數總和(hé / huò)爲(wéi / wèi)N，按如下反應體系配制：  

        将以(yǐ)上(shàng)配制的(de)反應體系充分混勻後，分裝至每個(gè)反應管中各19µl。分别取1.3.6中DNA 1µl，加入相應反應管中，蓋緊管蓋後5000r/min離心30秒。

1.4.2  擴增  将反應管放入熒光PCR儀内，記錄樣本擺放順序。反應參數爲(wéi / wèi)95℃預變性2分鍾；95℃變性5秒，58℃退火延伸15秒，共40個(gè)循環，熒光收集設置在(zài)每次循環的(de)退火延伸結束時(shí)進行（報告基團“FAM”，淬滅基團“NONE”）。

2  判定

2.1  結果分析條件設定  阈值設定原則：阈值線超過陰性對照擴增曲線的(de)最高點，且相交于(yú)陽性對照擴增曲線進入指數增長期的(de)拐點，或根據儀器噪聲情況進行調整。每個(gè)樣品反應管内的(de)熒光信号到(dào)達設定的(de)阈值時(shí)所經曆的(de)循環數即爲(wéi / wèi)Ct值。

2.2  結果成立條件  陽性對照Ct值＜30并出(chū)現特異的(de)擴增曲線，陰性對照無Ct值且無特異的(de)擴增曲線，試驗結果成立。

2.3  結果判定

2.3.1  被檢樣品Ct值≤35并出(chū)現特異的(de)擴增曲線，判爲(wéi / wèi)非洲豬瘟病毒核酸陽性。

2.3.2  被檢樣品無Ct值或Ct值≥40且無特異的(de)擴增曲線，判爲(wéi / wèi)非洲豬瘟病毒核酸陰性。

2.3.3  被檢樣品35＜Ct值＜40并出(chū)現特異的(de)擴增曲線，判爲(wéi / wèi)非洲豬瘟病毒核酸疑似，對疑似樣品，需重新取樣提取DNA，按雙倍模闆量（即2µl DNA）進行複檢，Ct值＜40并出(chū)現特異的(de)擴增曲線判爲(wéi / wèi)陽性，否則判爲(wéi / wèi)陰性。

【注意事項】  

（1）所有試劑應在(zài)規定的(de)溫度下保存。

（2）實驗室應分配液區、模闆提取區和(hé / huò)擴增區。工作流程順序爲(wéi / wèi)配液區→模闆提取區→擴增區。各區器材試劑專用，不(bù)可跨區使用。實驗結束後立即用1%次氯酸鈉或75%酒精或紫外燈消毒工作台。

（3）PCR擴增反應液應置于(yú)冰盒上(shàng)使用，其餘冷凍保存的(de)試劑使用前應室溫融化，再8000r/min離心15秒，使液體全部沉于(yú)管底。用畢所有試劑立即放回原處。

（4）離心管、吸頭等在(zài)實驗前應全部高壓滅菌。用滅菌的(de)鑷子(zǐ)夾取離心管，打開和(hé / huò)蓋上(shàng)離心管蓋時(shí)避免手和(hé / huò)手套接觸離心管口，若離心管開蓋時(shí)有液體粘在(zài)手上(shàng)或濺出(chū)，應立即更換手套。

（5）提取的(de)樣品，短期内使用放置于(yú)2～8℃或冰上(shàng)，長期應在(zài)-70℃以(yǐ)下保存，但仍以(yǐ)新鮮提取的(de)樣品效果最好。

（6）反應體系在(zài)特定配液區配制，配制和(hé / huò)分裝反應體系時(shí)應盡量避免産生氣泡，上(shàng)機前，5000r/min離心30秒，檢查各反應管是(shì)否蓋緊，以(yǐ)免熒光物質洩露污染儀器，整個(gè)實驗過程應嚴格控制污染。

（7）嚴格遵守操作說(shuō)明可以(yǐ)獲得最好的(de)結果。操作過程中移液、定時(shí)、轉速等全部參數必須精确。

（8）注意防止試劑盒組分受污染。不(bù)要(yào / yāo)使用超過有效期限的(de)試劑，不(bù)同批次試劑盒之(zhī)間的(de)組分不(bù)要(yào / yāo)混用。

（9）所有用于(yú)檢測的(de)廢棄物品均應放入含消毒液的(de)廢物缸内，高壓滅菌處理。

【規格】50份/盒

【批準文号】獸藥生字191538869