常見問題

• 【知識科普】核酸提取的(de)常用方法及原理

  目前常用的(de)核酸提取方法有兩種：一(yī / yì ／yí)種是(shì)柱式提取，另一(yī / yì ／yí)種是(shì)磁珠法提取。其中自動化提取的(de)實現主要(yào / yāo)依賴于(yú)磁珠法。

  
  

  柱式提取是(shì)用于(yú)微量核酸提取的(de)較爲(wéi / wèi)簡單的(de)方法，屬于(yú)矽吸附方法的(de)一(yī / yì ／yí)種，市場上(shàng)的(de)離心柱雖各有特色，但在(zài)原理上(shàng)通常可分爲(wéi / wèi)三個(gè)部分：

  (1)利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的(de)核酸釋放出(chū)來(lái)。

  (2)把釋放出(chū)的(de)核酸特異地(dì / de)吸附在(zài)特定的(de)矽載體上(shàng)，這(zhè)種載體隻對核酸有較強的(de)親和(hé / huò)力和(hé / huò)吸附力，對其他(tā)生化成分如蛋白質、多糖、脂類則基本不(bù)吸附，因而(ér)在(zài)離心時(shí)被甩出(chū)柱子(zǐ)。

  (3)把吸附在(zài)特異載體上(shàng)的(de)核酸用洗脫液洗脫下來(lái)，分離得到(dào)純化的(de)核酸。

  
  

  

  （柱式法圖解）

  
  

  磁珠法提取運用納米技術對超順磁性納米顆粒的(de)表面進行改良和(hé / huò)表面修飾後，制備成超順磁性氧化矽納米磁珠。該磁珠能在(zài)微觀界面上(shàng)與核酸分子(zǐ)特異性地(dì / de)識别和(hé / huò)高效結合。利用氧化矽納米微球的(de)超順磁性，在(zài)Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和(hé / huò)外加磁場的(de)作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的(de)DNA和(hé / huò)RNA分離出(chū)來(lái)，可應用在(zài)臨床疾病診斷、輸血安全、法醫學鑒定、環境微生物檢測、食品安全檢測、分子(zǐ)生物學研究等多種領域。

  
  

  
  

  

  （機器自動化磁珠法圖解）

  
  

• 【核酸提取常見問題】核酸提取量過少是(shì)什麽原因導緻的(de)？如何解決?

  核酸提取量過少，主要(yào / yāo)原因及解決措施如下：
  

  
  

  原因一(yī / yì ／yí)：實驗材料不(bù)佳或量少。

  解決方法：盡量選用新鮮（幼嫩）的(de)材料。

   

  原因二：材料破壁或裂解不(bù)充分。

  解決方法：動植物要(yào / yāo)勻漿研磨充分；G+菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁；高溫裂解時(shí)，時(shí)間适當延長（對于(yú)動物細胞、細菌可增加PK的(de)用量）。

   

  原因三：沉澱不(bù)完全。

  解決方法：(1)低溫沉澱，延長沉澱時(shí)間。(2)加輔助物，促進沉澱。

  
  

  原因四：洗滌時(shí)DNA丢失。

  解決方法：洗滌時(shí)，最好用槍頭将洗滌液吸出(chū)，勿傾倒。

  
  

• 【核酸提取常見問題】DNA降解是(shì)什麽原因導緻的(de)？如何避免？

  DNA降解，主要(yào / yāo)原因及解決方法如下：

  
  

  原因一(yī / yì ／yí)：材料不(bù)新鮮或反複凍融。

  解決方法：盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反複凍融。

   

  原因二：未很好抑制内源核酸酶的(de)活性。

  解決方法：(1)液氮研磨或勻漿組織後，應站在(zài)解凍前加入裂解緩沖液。

                   (2)在(zài)提取内源核酸酶含量豐富的(de)材料的(de)DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的(de)含量。

   

  原因三：提取過程操作過于(yú)劇烈，DNA被機械打斷。

  解決方法：細胞裂解後的(de)後續操作應盡量輕柔。

   

  原因四：被外源核酸酶污染。

  解決方法：所有試劑用無菌水配制，耗材經高溫滅菌。

   

  原因五：反複凍融。

  解決方法：将DNA分裝保存在(zài)緩沖液中，避免反複凍融。

  
  

• 【PCR實驗常見問題】無擴增産物（假陰性）的(de)可能原因及解決方法有哪些？
  
  

  無擴增産物（假陰性）的(de)可能原因及解決方法一(yī / yì ／yí)覽表
  序号	可能原因	解決方法
  1	模闆含有抑制物或模闆含量低	純化模闆或者使用試劑盒提取模闆DNA或加大(dà)模闆的(de)用量
  2	Buffer對樣品不(bù)合适	更換Buffer或調整濃度
  3	引物設計不(bù)當或者發生降解	重新設計引物（避免鏈間二聚體和(hé / huò)鏈内二級結構）或者換一(yī / yì ／yí)管新引物
  4	反應條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短	降低退火溫度、延長延伸時(shí)間

  
  

  
  

• 【PCR實驗常見問題】爲(wéi / wèi)何空白對照會出(chū)現目的(de)擴增産物（假陽性）？如何避免？

  空白對照出(chū)現目的(de)擴增産物，屬于(yú)出(chū)現了(le／liǎo)靶序列或擴增産物的(de)交叉污染，爲(wéi / wèi)避免這(zhè)種情況發生，應注意以(yǐ)下幾點：

  
  

  (1)實驗操作時(shí)小心輕柔，防止将靶序列吸入加樣槍内或濺出(chū)離心管外。

  
  

  (2)除酶及不(bù)能耐高溫的(de)物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一(yī / yì ／yí)次性使用。

  
  

  (3)各種試劑最好先進行分裝，然後低溫貯存。

  
  

• 【ELISA實驗常見問題】試驗結果白闆，而(ér)且陽性對照不(bù)顯色，可能原因及解決方法有哪些？

  試驗結果白闆，而(ér)且陽性對照不(bù)顯色，常見原因以(yǐ)及解決方法如下：

  
  

  (1)可能原因：漏加或者誤加試劑；

  解決方法：檢查試驗記錄和(hé / huò)剩餘試劑。每次加液前均應核對标簽。

  
  

  (2)可能原因：試劑過期；

  解決方法：使用有效期内的(de)産品。

  
  

  (3)可能原因：洗闆液配制中出(chū)現問題，如量筒不(bù)幹淨含HRP酶抑制物（疊氮鈉等）；

  解決方法：使用幹淨的(de)器皿，正确配制試劑。

  
  

  (4)可能原因：溫育的(de)時(shí)間或溫度不(bù)夠；

  解決方法：校正溫育箱溫度。

  
  

  (5)可能原因：标準品失活或者丢失；

  解決方法：标準品正确保存、溶解和(hé / huò)混勻。

  
  

  (6)可能原因：抗體失活或者丢失；

  解決方法：更換抗體或者提高抗體濃度。

  
  

  (7)可能原因：酶失活或者丢失；

  檢查方法：把工作濃度的(de)酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的(de)顯色底物，終止後顯色是(shì)否能達到(dào)1.0左右，此爲(wéi / wèi)酶的(de)粗略估計。

  解決方法：更換酶或者提高酶的(de)濃度。

  
  

  (8)可能原因：顯色底物失活；

  檢查方法：加少量的(de)工作濃度的(de)酶，TMB是(shì)否很快顯色。

  解決辦法：更換顯色底物。

• 【ELISA實驗常見問題】實驗結果空白背景高，是(shì)什麽原因造成的(de)？如何解決？

  ELISA實驗結果空白背景高，常見原因如下：
  

  
  

  (a)可能原因：洗闆不(bù)幹淨；

  解決方法：充分洗滌，徹底拍幹；洗闆要(yào / yāo)防止交叉污染；濃縮洗液準确配制；吸嘴盡可能一(yī / yì ／yí)次性使用；加樣或加酶拍闆的(de)濾紙應棄去不(bù)用，不(bù)要(yào / yāo)反複使用，否則易造成污染。

  
  

  (b)可能原因：顯色液變質或者試劑過期；

  解決方法：檢查試劑盒有效期。

  
  

  (c)可能原因：試劑稀釋有誤，如加酶的(de)濃度過高；

  解決方法：請按說(shuō)明書所示稀釋倍數配制；

  
  

  (d)可能原因：蒸餾水受酶等污染；

  解決方法：使用新鮮蒸餾水。

  
  

  (e)可能原因：試劑混用；

  解決方法：不(bù)同批号試劑勿混用。

  
  

  (f)可能原因：培養箱溫度超過37℃或反應時(shí)間過長；

  解決方法：顯色反應時(shí)間适當縮短。